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石蠟包埋組織切片免疫染色實(shí)驗(yàn)步驟 

實(shí)驗(yàn)步驟（建議方案）：

石蠟包埋組織切片3~4μm 厚度

1.烤片： 將待做切片置于切片架上，于60℃恒溫烤箱中至少烤1 hr；

2.脫蠟： 切片放入盛有二甲本苯的容器中脫蠟3次（即二甲本苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），每次10 min；

3.水化： 切片經(jīng)下行酒精水化，無(wú)水乙醇5min，95%乙醇2次（每次2min），85%乙醇2 min；75%乙醇2min，自來(lái)水沖洗，ddH2O洗2×2min；

4.抗原修復(fù)： 根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)推薦方法進(jìn)行抗原修復(fù)，常采用高壓、微波（溫度達(dá)到98~100℃）或酶消化修復(fù)法，室溫自然冷卻，自來(lái)水沖洗，ddH2O洗2×2min，TBS洗滌（2×2min）（具體修復(fù)方法見(jiàn)附1）* 注：有些抗原勿需修復(fù)，直接進(jìn)入第5步封閉。

5.封閉： 滴加試劑B，37℃濕盒孵育30 min；

6.加一抗：滴加用試劑C（即用型一抗），37℃濕盒孵育2 hr 或4℃過(guò)夜；

7.洗滌： TBS-T洗滌（3×5 min）；

8.封閉： 滴加試劑B，37℃濕盒孵育10 min；

9.加二抗： 滴加用抗體稀釋液稀釋的生物素化二抗（試劑D），37℃濕盒中孵育30 min；

10.洗滌： TBS-T洗滌（3×5 min）；

11.封閉： 滴加試劑Tween 20，37℃濕盒孵育封閉20 min；

12.加HRP-SA： 滴加用抗體稀釋液稀釋的試劑E（1：50~200，終濃度5~20 nM），37℃濕盒中孵育30 min；

13.洗滌： TBS-T洗滌（3×5 min），TBS洗滌（2×5 min）；

14.顯色：應(yīng)用DAB溶液（試劑F）顯色；

15.復(fù)染：自來(lái)水充分沖洗，復(fù)染，脫水，透明；

16.封片： 待組織標(biāo)本干后，用試劑緩沖甘油封固劑封片；

17.觀察成像： 顯微鏡下觀察成像。

注意事項(xiàng)：

1. 修復(fù)后緩沖液須自然冷卻，自來(lái)水沖洗后方能把切片取出，驟冷有可能導(dǎo)致結(jié)晶或抗原封閉。

2. 緩沖液的量必須保證所有切片都能浸泡到，用過(guò)的檸檬酸緩沖液不能反復(fù)使用。

3. 若試劑為微量濃縮液，用前應(yīng)低速離心，將內(nèi)蓋和管壁附著的溶液離到底部。

4. 封片前一定要換用TBS充分洗滌，以便洗去組織上殘留的Tween 20，否則會(huì)影響結(jié)果觀察。

5. 如須復(fù)染細(xì)胞核，則在封片前復(fù)染或直接采用含有染核試劑的封片劑進(jìn)行封片。

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