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神經(jīng)HRP示蹤顯色液(TMB 法)說明書
點擊次數(shù):1701 更新時間:2019-01-04

經(jīng)HRP示蹤色液(TMB法)說明書

 

上個世70年代,KristensopnOlsson 道了HRP可神經(jīng)末梢經(jīng)軸漿逆行至神經(jīng)元胞體,經(jīng)組織化學方法可示出神經(jīng)元的廓,從而發(fā)HRP  追蹤神經(jīng)示蹤技術(shù),即HRP 法。3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)是非常優(yōu)越的試驗顯,能

溶解于多有機溶和雙蒸水中,為穩(wěn)定的無色溶液,不適量氧化或雙氧水不沖液混   勻后,不氧化物作用產(chǎn)生清晰的產(chǎn)物,極易察,在辣根氧化物的催化下 , TMB 產(chǎn)色沉淀,沉淀溶于水和乙醇,色后呈色,可在察。

經(jīng) HRP 示蹤色液(TMB )經(jīng)麻醉、注入 HRP 后,游離或絡(luò)合型HRP 不氧化應(yīng)生成絡(luò)合物,該絡(luò)合物氧化供TMB ,呈色,在下清晰可,該檢測DAB  法靈敏。該顯色液用于科研領(lǐng)域,宜用于斷或其他用途。

 

 

產(chǎn)

 

 

 

 

50T

試劑(A): TMB assay buffer

2×500ml

RT 避 光

試劑(B): TMB  色液

30ml

-20℃ 避 光

試劑(C): TMB  強劑

2×1ml

RT

試劑(D): TMB Wash buffer(20×)

100ml

RT

 

操作步驟(供參考)

(一)、準工作

1、物麻醉:多用(3.5%)戊巴比麻醉,大鼠的麻醉0.25-0.35ml/100g。

2、HRP:有力注射法、泳法以及周經(jīng)統(tǒng)的注射涂抹等法。

3、確定物存活期。

4、物灌注:麻醉后,經(jīng)左心室升主脈插管行心內(nèi)灌注固定。先用生理水或 PBS 快速灌注。隨后用 4%的多聚甲固定液灌注,先快后慢,時間控制在 30-40min。后用 10% 蔗糖磷酸沖液(pH7.4)

5、材:組織置于 20%的蔗糖磷酸鹽緩沖液中,切片厚度 40μm,存于蔗糖磷酸鹽緩用。

(二)、色反應(yīng)

1、配制 TMB 孵育液:適量的TMB assay buffer TMB色液,按 TMB assay bufferTMB色液=39:1 的比例混合,即TMB孵育液,即配即用,宜保存。

2、配制TMB色工作液:適量的TMB孵育液和TMB強劑,按TMB孵育液:TMB 強劑=200080001 的比例混合(具體比例應(yīng)根據(jù)具體時間摸索確定),即TMB工作液,即配即用,宜保存。

3、配制 1×TMB Wash buffer適量的TMB Wash buffer(20×),按TMB Wash buffer: 蒸=1:19 的比例混合,即1×TMB Wash buffer。室溫保存6月有效。

4、切片用蒸水清洗 3 次,2min。

5、切片入10ml TMB孵育液(提前 20℃溫育),避光孵育20min,其斷晃

6、切片入10ml TMB 色工作液(提前 20℃溫育),避光孵育20min,其斷晃。7、漂洗:10ml左右的1×TMB Wash buffer 漂洗切片2-3 次,5min。

8片,玻片用明膠包被,室溫空氣干燥。

9、脫水、透明步驟按如下操作:

10s

②70%乙醇  10s

③95%乙醇  10s

④100%乙醇 2 次,10s

二甲苯2次,25min

  1. 中性膠封片,色反應(yīng)。

 

注意事

1、如果出現(xiàn)高的反應(yīng)背景或沉淀,表明TMB底物反應(yīng)過烈。

2、所用器皿必須潔凈,避免含有氧化,否產(chǎn)生非特異性反應(yīng)

3、TMB色液避免反復凍融,以免色效率下降。

4、TMB強劑注意密保存,否則顯色效率下降。

有效期: 12 個月內(nèi)有效。

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